12月4日，省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室、77779193永利灵长类转化医学研究院谭韬、季维智团队，与美国得克萨斯州西南医学中心吴军、中国农业大学魏育蕾、中科院动物所于乐谦合作，在CELL杂志发表题为Dissecting embryonic and extra-embryonic lineage crosstalk with stem cell co-culture的文章。

77779193永利灵长类转化医学研究院谭韬教授、季维智院士为文章的共同通讯作者，谭韬实验室博士研究生张娥、博士研究生慈百全为论文的共同第一作者。

该研究发现在同一种培养体系下可以建立小鼠和食蟹猴囊胚来源的ESCs、XENs和TSCs细胞系，通过干细胞共培养方式构建囊胚时期细胞互作环境，阐明了囊胚时期胚胎组织和胚外组织之间的相互作用及其调控机制。该研究不仅为胚胎和胚胎外组织之间互作机制解析提供了新的范式，也有助于深入理解早期胚胎发育的复杂调控模式。

哺乳动物中，生命是由单细胞受精卵发育而来。受精卵卵裂形成桑葚胚，桑葚胚细胞极化进一步发育形成具有不同谱系细胞类型的囊胚。囊胚对应的细胞谱系分别是：囊胚腔内由上胚层（Epiblast）和原始内胚层（Primitive endoderm）组成的内细胞团（Inner cell mass），未来发育成胎儿以及羊膜；囊胚外层致密的扁平细胞，称为滋养层（Trophectoderm），胚胎后期将发育成胎盘等组织；因此上胚层被称为胚内细胞，原始内胚层和滋养层被称为胚外细胞。胚内和胚外组织之间相互作用及其精确调控在维持干细胞自我更新及胚胎发育过程中起着重要作用。但由于囊胚特别是灵长类囊胚难以获得及研究手段有限，对于囊胚时期各谱系干细胞自我更新及其互作机制知之甚少，建立囊胚时期三谱系干细胞系并建立细胞胚胎发育体外模型是研究这一难题的有效手段之一。

研究团队首先采用激活FGF、TGF-β和WNT信号通路的方法成功从小鼠与食蟹猴囊胚中建立胚胎和胚外干细胞系 （FTW-ESCs，FTW-XEN和FTW-TSCs），并从克隆形态、免疫荧光、嵌合能力和转录组特征等多方面对小鼠与食蟹猴胚内、胚外干细胞系进行全面系统的研究（图1）。

A：小鼠FTW-mESCs/FTW-mTSCs/FTW-mXENs；B：食蟹猴FTW-cyESCs/FTW-cyTSCs/FTW-cyXENs。C：小鼠FTW-XEN、FTW-TSCs的胚外嵌合能力

基于这一培养体系，研究团队分别将小鼠和食蟹猴FTW-ESCs和其不同胚外干细胞（FTW-XENs, FTW-TSCs）进行共培养，发现FTW-ESCs增殖速度显著降低，表明XENs对ESCs的具有物种保守性的生长增殖有抑制作用。体内畸胎瘤实验结果也发现和单独注射小鼠FTW-ESCs形成的畸胎瘤相比，同时注射小鼠FTW-ESCs和FTW-XENs形成的畸胎瘤体积和重量明显减小。进一步地，研究人员通过剥除小鼠E6.5-6.75 天内脏内胚层（visceral endoderm, VE）24至48小时后发现，VE 剥离小鼠的EPI增值速度更快细胞且数量更多。通过在E2.5小鼠胚胎培养基中添加MEK/ERK抑制剂PD0325901抑制原始内胚层（primitive endoderm, PrE）形成，发现抑制PrE的胚胎其EPI的细胞数量和对照组胚胎相比显著增加，并且注射成系的FTW-XEN细胞后可以回复EPI细胞数量，进一步证明了PrE细胞对EPI细胞的增殖调控（图2）。

A-D：畸胎瘤实验；E-F：分离小鼠E6.5-7.5胚胎，+/-VE对Epi增殖的影响；H-J：囊胚期胚胎+/-VE体外培养证明VE对Epi的增殖抑制作用

为了揭示XENs （PrE）与ESCs （EPI）之间的互作机制，研究人员过对小鼠和食蟹猴共培养细胞和单独培养细胞进行了单细胞测序，数据分析显示XENs通过细胞外基质（如层粘连蛋白和胶原蛋白等）调控ESCs的增殖。通过在小鼠和食蟹猴FTW-ESCs培养基中加入不同细胞外基质（MATRIGEL，LAMININ，COLLAGEN IV等）有效抑制了FTW-ESCs的增殖。敲除小鼠FTW-XENsLaminin-γ1(Lamc1)或者敲除小鼠FTW-ESCsintegrin β1(Itgb1)可以减轻共培养的FTW-ESCs 的延迟生长（图3）。

灵长类原始内胚层细胞的自我更新机制研究相对处于空白。为了回答更好回答这个科学问题，研究团队首先从人的多能性干细胞分化获得稳定FTW-hXENs细胞系（hXENs），在一种培养条件对小鼠，食蟹猴和人等三个物种的胚外内胚层细胞做跨物种比较分析。团队找到了XENs保守调控的关键基因。除一些已知与原始内胚层发育相关的基因（例如GATA4, GATA6, SOX17, PDGFA）外，还包含一些之前未报道过与原始内胚层发育相关基因（例如SRC, JAK2, PIK3R1, CCL2），通过基因的敲除实验，进一步阐明这些新发现的功能基因XEN的不同物种多能性维持中起重要作用（图4）。

图4. 小鼠 (FTW-mXENs)、食蟹猴(FTW-cyXEN) 和人FTW-XENs (FTW-hXENs) 跨物种分析

综上所述，该研究成功在同一培养条件下获得小鼠与灵长类食蟹猴胚胎干细胞和胚外干细胞系，为剖析哺乳动物早期发育过程中不同谱系间细胞互作的分子机制开辟了新的途径。研究中开发的干细胞共培养条件不仅有助于建立更接近体内胚胎的干细胞胚胎模型，也为干细胞培养体系优化和分化提供了新的途径。

（供稿：灵长类转化医学研究院）